使用磷酸流式细胞仪检测实体瘤中的磷酸蛋白

本文中，我们将展示使用磷酸流式细胞仪对实体瘤中的磷酸化蛋白进行检测，并综述卡博替尼对肿瘤和宿主免疫细胞的PI3K/AKT和JAK-STAT信号传导抑制的分析。

  体内 efficacy of small molecule inhibitors is often assessed by measuring the phosphorylation state of cell signaling proteins within the pathways the drug targets. 当必须对实体瘤进行分析时，这可能是一个挑战。在利用啮齿动物模型的临床前研究中，最常见的肿瘤分析方法是免疫印迹和基于ELISA的技术。但是，这些批量分析方法有两个主要缺点。它们同时测量多个靶标的相对能力欠佳。更重要的是，他们无法分析异质肿瘤样本中多个不同子集中的靶标。当靶标信号蛋白在肿瘤微环境中的不同细胞类型（例如免疫细胞与肿瘤细胞）中具有相反的功能时，这可能很重要，而如果药物诱导作用在一个亚群中而不是在两个亚群中都发生，这一点甚至至关重要。

Labcorp has developed a novel phospho-flow-based platform that simultaneously analyzes multiple cell signaling targets in both the host immune cell and the tumor cell compartments derived from solid tumors. 这是通过在磷蛋白分析之前通过对泛造血细胞标记物CD45进行免疫表型分析以区分肿瘤细胞与浸润的宿主免疫细胞来实现。为证明该平台的效用，从采用FLT3抑制剂卡博替尼治疗的小鼠中采集的皮下MV-4-11肿瘤中测量了磷酸化STAT5和AKT下游靶标（S6）的水平。图1揭示了卡波替尼降低了人类(h)CD45+肿瘤细胞中pS6和pSTAT5的水平。在小鼠(m)CD45+宿主免疫细胞（未显示）中未观察到这些磷酸蛋白水平的变化。因此，获得了对PI3K/AKT和JAK-STAT信号传导活性的深入了解，它们既是调节肿瘤生长和宿主免疫力的有据可查的途径，又是治疗干预的有吸引力的靶点。

图1：STAT5和MAPK信号传导的实体瘤磷酸化流式分析。

MV-4-11是一种急性骨髓性白血病（AML）模型，急性骨髓性白血病是由若干基因之一的基因突变驱动的恶性肿瘤。最常见的事件发生在FLT3基因中，这会导致组成型活性FLT3蛋白通过触发过度活跃的PI3K/AKT和JAK-STAT信号传导来驱动癌细胞的增殖。¹卡波替尼介导的FLT3抑制作用可抑制MV-4-11肿瘤体内生长，与体外抑制AKT和STAT信号传导相关。²尽管有充分的记录表明，过度活跃的PI3K/AKT和JAK-STAT5信号在许多模型中驱动了肿瘤生长，这些信号蛋白的活化也是T细胞活化和记忆T细胞生成所必需的。^3,4,5这种此消彼长强调了能够同时分析实体肿瘤来源的免疫和肿瘤细胞中磷酸化蛋白的重要性。

Tumor phospho-flow at Labcorp has potential to advance the cell signaling field. 2010年介绍了肺和腹膜肿瘤中的实体组织磷酸化流式分析。⁶自那时起，鲜有其他成功方案的报告。最近，一种名为DISSECT的方法结合细胞计数法，被成功用于测量上皮样本中的磷酸化蛋白，后又被用于测量结直肠肿瘤中的磷酸化蛋白^。7,8需要注意的是，这些方法要求在采集组织后进行固定，这可能会改变被用于免疫表型和信号分析的荧光抗体结合的表位。这可能会限制该技术提供的数据量。 Solid tumor phospho-flow at Labcorp does not require fixation, prior to immuno-staining. 这有助于我们针对不同人群进行分析。我们正在努力扩大我们的能力。正在开展的研究侧重于开发新的实体瘤磷酸化流式检测服务，这些服务将能够同时分析特定T细胞亚群和肿瘤细胞中体内治疗诱导的效应。

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参考资料

²Lu, J. W.；Wang, A. N.；Liao, H. A.；Chen, C. Y.；Hou, H. A.；Hu, C. Y.；… & Lin, L. I. (2016)。卡博替尼在具有内部串联重复的急性骨髓性白血病细胞中具有选择性细胞毒性(FLT3-ITD)。 Cancer letters, 376(2), 218-225.

³Vara, J. Á. F.；Casado, E.；de Castro, J.；Cejas, P.；Belda-Iniesta, C.和González-Barón, M. (2004)。PI3K/Akt信号传导途经与癌症。 Cancer treatment reviews, 30(2), 193-204.

⁴Rani, A.和Murphy, J. J. (2016)。癌症中的STAT5与imCantrell, D.（2002年2月）。

⁵T淋巴细胞中的蛋白激酶B（Akt）调节和功能。 In Seminars in immunology (Vol. 14, No. 1, pp. 19-26). 学术出版社。

⁶Lin, C. C.；Huang, W. L.；Su, W. P.；Chen, H. H.；Lai, W. W.；Yan, J. J.和Su, W. C. (2010)。 Single cell phospho‐specific flow cytometry can detect dynamic changes of phospho‐Stat1 level in lung cancer cells. Cytometry Part A, 77(11), 1008-1019.

⁷Simmons, A. J.；Banerjee, A.；McKinley, E. T.；Scurrah, C. R.；Herring, C. A.；Gewin, L. S.; …和Irish, J. M. (2015)。 Cytometry‐based single‐cell analysis of intact epithelial signaling reveals MAPK activation divergent from TNF‐α‐induced apoptosis in vivo. Molecular systems biology, 11(10), 835.